引物磷酸化的作用(引物为什么要去磷酸化)

引物为什么要去磷酸化

1、DND聚合酶——又称DNA依赖的DNA聚合酶

它是以DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下：

Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，从Thermus aquaticus中分离出来，是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系，Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化，其中最为熟知的就是热启动Taq酶.

热启动Taq酶：该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰，其原理都是：在反应体系加热至高温之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制，进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外，还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。

Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilus的DNAPolymerase I，经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常适合于防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。

由于此次新冠的影响，Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿。

除了Bst外，还有其他类似功能的链置换DNA聚合酶，如如Bca best聚合酶、 Klenow聚合酶、phi29DNA聚合酶等。

Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的现象是：在Mg2+条件下，Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。

2、逆转录酶——又称为RNA依赖的DNA 聚合酶

该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。

3、RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶

也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。如仁度、中帜的RNA扩增方法中就需要使用RNA聚合酶。

4、蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。

5、UDG酶——高效控制PCR残余污染

尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。

因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。卫生部明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。

UDG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT或者。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。

热敏性UDG: 除了常规UDG外，现在也开发出热敏型UDG，热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG，热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。

6、限制性核酸内切酶——识别并剪切特定的脱氧核苷酸序列

限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。

常用的酶，如BsoB I, Hinc II，Nt.BstNBI切刻内切酶。其中，BD公司的链置换扩增术(stranddisplacement amplification,SDA)等温PCR系统中选择的酶需具有切割位点专一性，且对识别位点的化学修饰敏感。新冠疫情中Abbott 的明星产品ID NOW等温PCR系统中，就采用Nt.BstNBI内切酶。

7、解旋酶，helicase——使双链DNA变成单链DNA

利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；

常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；大肠杆菌解旋酶II（UvrD），其解链速度是20bp/s，对反应速度有很大的制约性。T7噬菌体的解旋酶gp4解旋酶的解链速度更快，可达400bp/s，可以大大提高反应速度。

目前，Quidel等温PCR系统HAD中采用此酶

引物磷酸化修饰

gtp在化学中是三磷酸鸟苷 (Guanosine triphosphate, GTP)即鸟嘌呤-5'-三磷酸。在生物化学的全名为9-β-D-呋喃核糖鸟嘌呤-5'-三磷酸，或者是9-β-D-呋喃核糖-2-氨基-6-氧-嘌呤-5'-三磷酸。GTP是DNA复制时的引物（Primer，其实是RNA）和转录（即是mRNA的生物合成）时的鸟嘌呤核苷酸的提供者。

引物降解的原因

PCR引物没那么脆弱,你做 PCR 的时候常温用都可以。而且引物订回来是要稀释很多倍的,你先稀释到一个储存浓度,再取一些稀释到使用浓度就可以啦,剩下的储存浓度就一直放—20度保存呗!不能反复冻融就是怕降解了。

引物磷酸化是什么意思

DNA扩增技术即基因扩增技术，又称无细胞分子克隆技术或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。

DNA扩增技术具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点。其基本原理为：

1、将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链；

2、加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物；

3、引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。

合成的引物是磷酸化

需要,目前已知的DNA聚合酶都没有合成一条全新链的能力,需要引物提供3‘-OH才能开始延伸。

DNA复制的保守性主要靠包括聚合酶外切活性在内的校正和修复系统。DNA复制中引发酶合成的引物是RNA，它本身就有较高的错误率，在复制完成前是要被切除的，这和PCR是不同的。冈崎片段就是通过引发酶“从头合成“的。

如果生物体内DNA复制也需要DNA引物，而且不切除，那么引物片段错配的发生反而会降低保守性。

DNA聚合酶不能催化DNA新链从头合成，只能催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端。因而复制之初需要一段RNA引物的3’一OH端为起点，合成5’→3’方向的新链。

引物为什么要去磷酸化呢

质粒和PCR产物需要拿去测序有2个目的，一是验证插入序列的DNA序列是否无误。第二是看插入的方向和位置是否正确。如果做定量PCR用到质粒的话，一般是用来做标准曲线的。

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

引物磷酸化和退火

退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降;温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。

引物磷酸化修饰之后会有什么样的变化

DNA在复制的时候，在DNA解旋酶的作用下，双链首先解开，形成了复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质和酶参与的较复杂的复制过程。

特点：

1、半保留复制

全保留复制模型中，DNA分子解旋形成两条模板链，模板链复制形成子链，然后两条模扳链DNA彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链DNA分子。

半保留复制模型中，DNA分子解旋形成两条模板链，模板链复制形成子链，然后两条模板链分别与新合成的子链组成子代DNA分子。

最终，科学家证明DNA复制的方式为半保留复制。

2、半不连续复制

DNA双螺旋由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开形成一个复制叉。两条单链分别作为模板，各自合成一条新的DNA链。由于DNA分子中一条链的走向是5’→3’方向，另一条链的走向是3’→5’方向，而且生物体内的DNA聚合酶只能催化DNA从5’→3’的方向合成。所以DNA复制时，其中一条链是连续合成的，另外一条链是不连续合成的。

加入引物的原因

我们都知道，DNA复制需要DNA聚合酶，而DNA聚合酶的特点是不能从头合成DNA的一条链。也就是说不能从单个游离的脱氧核苷酸合成DNA链，因此要加入引物。所谓引物就是与DNA模板链互补的核苷酸片段，带有一个游离的-OH（羟基）末端，便于与游离的脱氧核苷酸结合，形成一个磷酸二酯键。所以没有引物，DNA就不能够复制。

做连接时引物为什么要磷酸化

引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

自然中存在有生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应（PCR）中人工合成的引物（通常为DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。

上游引物：DNA分子两端不一样，因为核苷酸分子不是对称的，5'位有个磷酸，3'位是-OH就是：磷酸端和羟基端。DNA复制总是从5’端到3’端，因为DNA聚合酶只能往3’端加核苷酸。所以谁先复制谁上游，往后的就是下游，上游下游是个相对概念，是某一个序列/碱基相对于另一个序列/碱基而言。上游引物是靠近5'端的，下游引物是靠近3‘端的。

DNA是双链，两个链是反向平行的，DNA聚合酶顺着其中一个链走，这个链就是负链，另一个链是反着一段一段复制的，这个是正链。

正义链（sensestrand）是上游引物，反义链（antisensestrand）是下游引物，链的合成方向是从5‘~3’。上游引物又叫正向引物,下游引物叫反向引物，在设计引物的时候一般是以其中的一条链来设的,所以上游引物是与这条链相同的，而反向引物则要反向互补后才行。

上下游引物长度可以不同，主要是两条引物的Tm值要接近不然会降低扩增效率PCR扩增并不要求上下游引物一定要相同长度。但是，如果上下游引物长度相差太远，并不利于扩增反应的进行。这一点可以从primer5.0中的引物评分可以看出来。因此，除非迫不得已，建议将两条引物长度设计的相近，这样引物评分要高一些。也有利于扩增反应的进行。